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1.產(chǎn)品簡介　

rProtein A/G Beads 4FF 是將 rProtein A/G 高密度定向偶聯(lián)到高度交聯(lián)的瓊脂糖凝膠微球表面，該產(chǎn)品具有更高的抗體結(jié)合能力和較低的蛋白非特異吸附率，洗脫條件更均一，一步純化即可從血清樣品中分離出純度大于 90%的抗體。產(chǎn)品性能見表1。

本產(chǎn)品主要用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究，也可用于抗體固定及其它相關(guān)研究。用戶可根據(jù)目標(biāo)抗體的種屬來源及亞型選擇微球的類別，Protein A，Protein G 和 Protein A/G 與不同抗體的親和性比較參見表2。

表 1. rProtein A/G Beads 4FF 產(chǎn)品性能

表 2. Protein A、Protein G 和 Protein A/G 對不同抗體的結(jié)合能力

++++=結(jié)合能力強(qiáng)； ++=結(jié)合能力中等； —=結(jié)合能力弱或沒有結(jié)合

純化流程

本產(chǎn)品主要應(yīng)用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究。

2.1 緩沖液的準(zhǔn)備

所用水和緩沖液在使用之前建議用 0.22μm 或 0.45μm 濾膜過濾。

平衡/ 洗雜液: 0.15M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH 7.0

洗脫液: 0.1M 甘氨酸，pH 3.0

中和液：1M Tris-HCl，pH 8.5

交聯(lián)液：0.2 M 三乙醇胺, pH 8.2

交聯(lián)劑：DMP（dimetyl pimelimidate dihydrochloride）

終止液：50 mM Tris, pH 7.5

2.2 樣品準(zhǔn)備

上柱之前要確保樣品溶液有合適的離子強(qiáng)度和pH 值，可以用平衡/洗雜液對血清樣品、腹水或細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，或者樣品用平衡/洗雜液透析。對于100 mm 培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，使用預(yù)冷PBS洗滌一次后加入2ml細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。對于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞后，PBS洗滌一次后參考貼壁細(xì)胞的裂解方法進(jìn)行裂解。植物或動物組織樣品可以使用液氮研磨方法裂解。具體的裂解方法請參考不同裂解液的使用說明，裂解液最終總蛋白濃度選擇在 0.5-1μg/μl范圍內(nèi)較為合適。通常針對目標(biāo)蛋白的表達(dá)量不同，需要對總蛋白濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整。

2.3. 去除非特異性結(jié)合（可省略）

1) 取200微升至1毫升蛋白樣品，加入約1微克和免疫沉淀時(shí)使用的IgG種屬相同的Normal IgG和20微升充分重懸的rProtein A/G Beads 4FF，4℃緩慢搖動30分鐘。

2) 2500rpm (約1000g)離心1分鐘，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。

注：哺乳動物細(xì)胞內(nèi)有多種成分可以和IgG 發(fā)生結(jié)合，可能會在后續(xù)免疫印跡中出現(xiàn)非特異性條帶。使用 normal IgG 和 rProtein A/G Beads 4FF 對裂解液預(yù)處理可以降低非特異性吸附。

2.4 免疫沉淀操作流程

免疫沉淀直接法操作流程示意圖如下：

2.4.1 抗體吸附

1）取適量的 rProtein A/G Beads 4FF 加入到 2ml 離心管中，800rpm 離心 1min，吸棄 上清。

2) 加入 0.5ml 平衡液，懸浮填料（使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下，起到保護(hù)蛋 白的作用），800rpm 離心 1min，吸棄上清。再重復(fù)兩次。

3) 向步驟 2) 平衡的填料中加入抗體溶液，懸浮填料，室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，約 30min 后，800rpm 離心 1min，收集上清液，留待檢測。

4) 向 3) 的填料中加入 0.5ml 的洗雜液，懸浮填料，進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋 白，800rpm 離心 1min，吸棄上清。再重復(fù)兩次。

2.4.2 抗體交聯(lián) (備選)

如果需要將抗體和目標(biāo)抗原復(fù)合物共同洗脫，請忽略本步驟，直接進(jìn)行 2.4.3。50ul-1ml 填料量均可以按照以下步驟操作，無需額外增加交聯(lián)液體積。

1) 向清洗過的填料中加入1ml 交聯(lián)液，800rpm離心1min，吸棄上清。

2) 再向其中加入1ml 含20 mM DMP（dimetyl pimelimidate dihydrochloride）的交聯(lián)液，此試劑需要現(xiàn)用現(xiàn)配，懸浮填料，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，促使緩沖液和填料充分接觸， 約 30min 后，800rpm 離心1min，吸棄上清。

3) 再向其中加入1ml 終止液，懸浮填料，終止交聯(lián)反應(yīng)，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管， 約 15min 后，800rpm 離心 1min，再吸棄上清。

4) 加入0.5ml 的洗雜液，懸浮填料，進(jìn)行清洗，800rpm 離心1min，吸棄上清。再重復(fù)兩次。

2.4.3 抗原沉淀反應(yīng)

1) 抗原吸附：加入含有抗原的樣品，用移液器輕輕吹打使抗原與填料-抗體復(fù)合物均勻分散。在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管10min，使抗原與抗體充分結(jié)合，如結(jié)合力較弱則可在室溫下反應(yīng)1h或者在4℃下反應(yīng)過夜。

2) 洗雜：將上述完成抗原吸附的填料-抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行離心，800rpm 離心 1min，收 集上清液，置于冰上以備后續(xù)檢測。向離心管中加入1ml洗雜液，用移液器輕輕吹打使填料-抗體-抗原復(fù)合物均勻分散，然后進(jìn)行離心分離，800rpm 離心 1min，棄上清液。 再重復(fù)洗滌兩次。最后加入 1ml 洗雜液，用移液器將填料-抗體-抗原復(fù)合物懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中，并進(jìn)行離心分離，800rpm 離心 1min，棄上清液。

3) 抗原洗脫：提供以下兩種抗原洗脫方案，可根據(jù)后期檢測的需要選擇不同的抗原洗脫方法。

變性洗脫法：此方法洗脫的樣品適用于 SDS-PAGE 檢測。向離心管中加入 25μl 1× SDS-PAGE Loading Buffer 混合均勻，95℃ 加熱5min。然后進(jìn)行離心，800rpm 離心 1min，收集上清液，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行Western分析。

非變性洗脫法：此方法洗脫的樣品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向離心管中加入5倍柱體積的洗脫液，用移液器吹打5次，混勻，然后在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者 手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管，10min后，離心，800rpm 離心 1min，吸取上清液，收集洗脫組分，即為目標(biāo)抗原，收集上清液至新的離心管中，并立即加入十分之一體積的中和液，將洗脫組分pH調(diào)節(jié)至7.0-8.0，用于后期功能分析。